Trong sinh học phân tử, primer và probe đóng vai trò quyết định thành công của nhiều kỹ thuật, đặc biệt là PCR và qPCR. Sự chính xác trong thiết kế, chất lượng sản xuất và độ tinh khiết của các oligonucleotide này trực tiếp ảnh hưởng tới độ đặc hiệu, độ nhạy và khả năng tái lập kết quả thí nghiệm.

Bài viết này sẽ cung cấp cái nhìn toàn diện về primer & probe: từ khái niệm, phân loại, quy trình sản xuất, các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng, cho tới các thương hiệu uy tín toàn cầu. Bài viết gồm các nội dung chính sau:

1. Primer và Probe là gì?

1.1 Primer

Primer là các đoạn oligonucleotide (thường dài 18–25 nucleotide) được thiết kế để gắn vào vùng đặc hiệu trên khuôn DNA hoặc RNA (sau khi phiên mã ngược) nhằm khởi đầu quá trình tổng hợp DNA mới bởi enzyme DNA polymerase.

Trong phản ứng PCR, cần ít nhất hai primer :

• Forward primer: gắn vào mạch bổ sung, mở đầu tổng hợp theo chiều 5’ → 3’.
• Reverse primer: gắn vào mạch gốc, tổng hợp theo hướng ngược lại.

Minh họa về Primer và cách Primer hoạt động

1.2 Probe

Probe là đoạn oligonucleotide có gắn chất phát huỳnh quang (fluorophore) và chất dập tín hiệu (quencher), cho phép theo dõi sự xuất hiện của sản phẩm PCR trong thời gian thực (real-time PCR).

Trong PCR, probe là một đoạn oligonucleotide ngắn được thiết kế đặc hiệu để gắn vào một trình tự DNA mục tiêu nằm giữa hai primer. Khác với primer, probe thường được đánh dấu bằng một chất huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất dập tín hiệu (quencher) ở đầu 3’. Khi phản ứng PCR diễn ra, hoạt động của enzyme DNA polymerase sẽ tách chất huỳnh quang khỏi quencher, tạo ra tín hiệu ánh sáng tỷ lệ với lượng DNA được nhân lên. Nhờ đó, probe giúp tăng tính đặc hiệu và cho phép PCR định lượng thời gian thực (qPCR) phát hiện, định lượng chính xác trình tự gen mục tiêu.

Các loại probe phổ biến:

• TaqMan probe: Là probe nhãn kép (reporter–quencher), sử dụng hoạt tính exonuclease 5′→3′ của enzyme Taq polymerase để tách báo hiệu huỳnh quang trong quá trình tổng hợp DNA.
  Cấu trúc: gắn chất huỳnh quang (reporter) ở 5’ và chất dập tín hiệu (quencher) ở 3’.
  Nguyên lý: bị enzyme Taq polymerase cắt trong quá trình kéo dài, giải phóng tín hiệu huỳnh quang.
  Ưu điểm: độ đặc hiệu và độ chính xác cao.
  Nguồn :https://www.laboratorynotes.com/sequence-specific-probe-based-quantitative-pcr-qpcr/
  
  

• Molecular beacon: Có cấu trúc dạng "kẹp tóc" (stem-loop), gồm reporter và quencher ở hai đầu. Khi không bắt cặp, probe ở trạng thái đóng, tín hiệu bị dập; khi gặp trình tự mục tiêu, vòng “mở ra” và phát huỳnh quang.
  Cấu trúc: dạng “kẹp tóc” (hairpin loop) với reporter và quencher ở hai đầu.
  Nguyên lý: chỉ phát huỳnh quang khi mở vòng và bắt cặp hoàn toàn với trình tự đích.
  Ưu điểm: hạn chế tín hiệu nền, phân biệt rõ đích và không đích.
  Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/Molecular_beacon
  
  
• Scorpion probe:
  Kỹ thuật Scorpion được phát triển bởi Tiến sĩ David Whitcombe của DxS Ltd. Mồi Scorpion là các phân tử lưỡng chức, trong đó mồi được liên kết cộng hóa trị với đầu dò. Các phân tử này cũng chứa một phân tử huỳnh quang và một chất dập tắt. Khi không có mục tiêu, chất dập tắt gần như hấp thụ huỳnh quang do phân tử huỳnh quang phát ra. Trong phản ứng PCR Scorpion, khi có mục tiêu, phân tử huỳnh quang và chất dập tắt tách ra, dẫn đến sự gia tăng huỳnh quang phát ra. Huỳnh quang có thể được phát hiện và đo lường trong ống phản ứng. (Tham khảo)
  
  Cấu trúc: Sự kết hợp giữa primer và probe trong cùng một phân tử (unimolecular). 
  Nguyên lý: khi kéo dài sợi DNA, probe gắn với trình tự đích và phát huỳnh quang.
  Ưu điểm: tốc độ phản ứng nhanh, tín hiệu mạnh.
  
  
• Các loại probe khác (dual hybridization, MGB, HyBeacon...)
  Ngoài các loại trên, còn có những probe khác như Dual Hybridization probes (một dùng donor và một acceptor để FRET), Eclipse®, MGB probe, HyBeacon™, v.v. Những loại này thường sử dụng cơ chế hybrid hóa kết hợp hoặc có chất tăng liên kết (minor groove binder).Cấu trúc: probe gắn thuốc nhuộm huỳnh quang nhưng không có quencher.
  Nguyên lý: phát huỳnh quang khi bắt cặp với trình tự đích ở nhiệt độ nhất định.
  Ưu điểm: thường dùng để phân tích điểm nóng chảy (melting curve).
  
  

  Loại Probe	Cơ chế tác động	Ưu điểm chính
  TaqMan® Probe	Cắt bởi enzyme, tách reporter–quencher	Độ chính xác cao, dễ multiplex
  Molecular Beacon	Mở vòng khi bắt cặp, phát huỳnh quang	Giảm tín hiệu nền, đặc biệt
  Scorpion Probe	Hairpin unimolecular	Tín hiệu nhanh và mạnh, đơn giản
  Khác (MGB, Dual...)	Hybrid hóa hoặc gắn chất phục xúc tác	Tăng độ bền, linh hoạt mục tiêu

2. Vai trò của primer và probe trong PCR

Định hướng khuếch đại: primer quyết định đoạn DNA nào sẽ được nhân bản.

Độ đặc hiệu: sequence của primer/probe phải chỉ bắt cặp với trình tự mục tiêu, tránh bắt nhầm.

Tăng độ nhạy: probe giúp phát hiện sản phẩm ngay khi đang diễn ra phản ứng.

Định lượng chính xác: qPCR sử dụng probe cho phép định lượng tuyệt đối hoặc tương đối số bản sao của gene mục tiêu.

3. Quy trình sản xuất primer và probe

Quá trình sản xuất primer/probe là sự kết hợp giữa hóa học tổng hợp DNA và công nghệ tinh sạch hiện đại.

3.1 Nguyên tắc tổng hợp oligonucleotide

• Sử dụng phương pháp phosphoramidite tổng hợp từng nucleotide từ 5’ → 3’.
• Mỗi chu kỳ gắn một nucleotide mới, trải qua các bước: khử bảo vệ, kích hoạt, ghép nối, và cố định liên kết.
• Các fluorophore, quencher hoặc nhóm chức đặc biệt được gắn trong quá trình tổng hợp hoặc sau tổng hợp.

3.2 Các bước cơ bản

1. Chuẩn bị vật liệu rắn (solid support): thường là hạt silica hoặc polystyrene.
2. Tổng hợp từng base theo thứ tự mong muốn.
3. Gắn nhóm chức đặc biệt (FAM, HEX, BHQ…) nếu cần.
4. Cắt oligo ra khỏi vật liệu rắn và loại bỏ nhóm bảo vệ.
5. Tinh sạch bằng HPLC hoặc PAGE để loại bỏ sản phẩm chưa hoàn chỉnh.
6. Kiểm tra chất lượng (QC): đo OD260, phân tích bằng MALDI-TOF, CE.
7. Đóng gói và bảo quản ở dạng khô hoặc dung dịch, bảo quản lạnh.
8.  

9. 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng primer & probe

   4.1 Chất lượng nguyên liệu

   • Nucleotide phosphoramidite phải có độ tinh khiết cao (>98%).
   • Fluorophore và quencher cần ổn định, không bị suy giảm tín hiệu.

    => Monomer nucleotide, thuốc thử và dung môi phải đạt chuẩn hóa học & sinh học (molecular biology grade).

10.  

11. 4.2 Quy trình tổng hợp

    • Máy tổng hợp oligo phải chính xác trong từng chu kỳ.
    • Kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm và pH để tránh phản ứng phụ.

     Hiệu quả gắn chất huỳnh quang và quencher phải đạt mức cao, đồng thời tránh phân hủy hoặc thất thoát trong quá trình tổng hợp.

12.  

13. 4.3 Phương pháp tinh sạch

    • HPLC: tinh sạch cao, cần thiết cho probe và primer đặc biệt.
    • PAGE: loại bỏ sản phẩm ngắn, dùng cho oligo dài.
    • Desalted: đủ cho PCR thông thường, nhưng không khuyến nghị cho qPCR.
14.  

15. 4.4 Bảo quản và vận chuyển

    • Oligo khô ổn định ở -20°C; dung dịch dễ bị thủy phân hơn.
    • Vận chuyển cần bảo quản lạnh (đặc biệt với probe gắn fluorophore).

     

16. 5. Phân loại primer và probe

    5.1 Theo mục đích sử dụng

    • Primer PCR thông thường: không gắn nhãn, dùng cho phản ứng PCR điểm cuối.
    • Primer RT-PCR: dùng cho phiên mã ngược.
    • Primer qPCR: thường kết hợp với probe.

     

17. 5.2 Theo cấu trúc và nhãn gắn

    • Unmodified primer: không có gắn nhãn.
    • Labeled primer: gắn fluorophore hoặc biotin.
    • TaqMan probe: gắn fluorophore và quencher.
    • Molecular beacon: cấu trúc vòng thân.
18.  

19. 5.3 Theo độ tinh sạch

20. • Desalted (khử muối cơ bản):
      Là bước xử lý cơ bản nhất, loại bỏ muối và dung môi dư sau khi tổng hợp.
      Ưu điểm: Chi phí thấp, thời gian sản xuất nhanh.
      Nhược điểm: Không loại bỏ hoàn toàn các oligonucleotide chưa hoàn thiện, có thể ảnh hưởng đến các ứng dụng yêu cầu độ đặc hiệu cao.
      Ứng dụng: PCR thông thường, phản ứng không đòi hỏi độ tinh sạch cao.
      
      
    • Cartridge (Tinh sạch bằng cột)
      Mô tả: Sử dụng cartridge (cột lọc silica hoặc polymer) để loại bỏ phần lớn các sản phẩm tổng hợp lỗi và tạp chất hữu cơ.
      Ưu điểm: Chất lượng cao hơn desalted, vẫn giữ được chi phí hợp lý.
      Nhược điểm: Không đạt độ tinh sạch tuyệt đối cho các ứng dụng phân tích chuyên sâu.
      Ứng dụng: PCR, qPCR, giải trình tự Sanger với yêu cầu trung bình về độ tinh sạch.
      
      
    • HPLC (High-Performance Liquid Chromatography)
      Mô tả: Tách oligonucleotide theo kích thước và đặc tính hóa học bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
      Ưu điểm: Độ tinh sạch rất cao, loại bỏ gần như hoàn toàn sản phẩm sai.
      Nhược điểm: Chi phí cao hơn, thời gian sản xuất lâu hơn.
      Ứng dụng: qPCR, PCR định lượng, nghiên cứu gen, phát hiện đột biến, các xét nghiệm chẩn đoán yêu cầu độ chính xác cao.
      
      
    • PAGE (Điện di trên gel polyacrylamide)
      Mô tả: Tách primer/probe dựa trên kích thước và độ dài chuỗi bằng điện di gel polyacrylamide.
      Ưu điểm: Loại bỏ hoàn toàn các sản phẩm sai khác kích thước, đảm bảo độ đồng nhất gần như tuyệt đối.
      Nhược điểm: Quy trình thủ công phức tạp, chi phí cao.
      Ứng dụng: Các nghiên cứu cấu trúc DNA/RNA, tạo oligonucleotide dài hoặc yêu cầu độ tinh sạch tuyệt đối như trong thí nghiệm cấu trúc hoặc liệu pháp gen.

6. Mức độ khó khi thiết kế và sản xuất primer/probe

6.1 Thách thức trong thiết kế

• Tránh vùng lặp lại hoặc vùng giàu GC quá mức.
• Đảm bảo Tm giữa forward và reverse primer tương đồng.
• Tránh dimer và hairpin.
• Đối với probe, vị trí đặt phải nằm trong đoạn được khuếch đại và tránh trùng với primer.

6.2 Thách thức trong sản xuất

• Gắn nhãn fluorophore và quencher yêu cầu kỹ thuật cao.
• Tinh sạch đạt >95% với probe dài là thách thức.
• Kiểm soát đồng đều chất lượng giữa các lô.

7. Các hãng nổi tiếng sản xuất primer/probe

7.1 Eurogentec (Bỉ)

• Ưu điểm:
  • Sản xuất theo tiêu chuẩn ISO 13485 và GMP
  • Có dòng sản phẩm CE-IVD cho chẩn đoán lâm sàng
  • Đa dạng tùy chọn: TaqMan, LNA, beacon, gắn nhiều loại fluorophore
  • Hỗ trợ thiết kế miễn phí, QC chi tiết
• Tại Việt Nam: phân phối chính thức bởi Pacificlab và Thái Dương Solution
• Ứng dụng: từ nghiên cứu cơ bản tới kit chẩn đoán đạt chuẩn y tế
  

7.2 IDT (Integrated DNA Technologies – Mỹ)

• Thị phần lớn toàn cầu
• Giá cạnh tranh, giao hàng nhanh
• Dịch vụ online mạnh

7.3 Sigma-Aldrich / MilliporeSigma

• Sản phẩm đa dạng, chất lượng ổn định
• Hệ thống phân phối rộng
• Giá thành cao

7.4 Macrogen (Hàn Quốc)

• Giá hợp lý
• Dịch vụ giải trình tự kết hợp đặt oligo

7.5 Bioneer (Hàn Quốc)

• Nổi bật ở thị trường châu Á
• Nhiều gói dịch vụ trọn gói PCR/qPCR

8. Làm sao để lựa chọn primer & probe

1. Chọn nhà cung cấp uy tín – ưu tiên thương hiệu có tiêu chuẩn ISO 13485.
2. Tinh sạch phù hợp – PCR thường có thể dùng desalted primer, nhưng qPCR phải dùng HPLC/PAGE.
3. Bảo quản đúng cách – tránh đông tan nhiều lần.
4. Kiểm tra sequence – sử dụng phần mềm thiết kế như Primer3, OligoAnalyzer.
5. Hỏi tư vấn kỹ thuật – tận dụng dịch vụ hỗ trợ của nhà cung cấp.

7. Primer và probe không chỉ là “vật tư tiêu hao” trong PCR mà là yếu tố quyết định độ chính xác, độ nhạy và tính tái lập của kết quả. Hiểu về quy trình sản xuất, các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng, cũng như thương hiệu uy tín sẽ giúp nhà nghiên cứu tối ưu hiệu quả và tiết kiệm chi phí.

9. Trong số các nhà cung cấp primer & probe toàn cầu, Eurogentec nổi bật với chất lượng đạt chuẩn y tế châu Âu, dịch vụ thiết kế chuyên sâu và khả năng cung cấp đa dạng sản phẩm primer/probe cho cả nghiên cứu và chẩn đoán.

10.  
11. Thái Dương Solution – Nhà cung cấp hóa chất - Thiết bị phòng thí nghiệm
    ???? 0985 554 054 | ???? https://thaiduong-solution.vn/