Ứng dụng của cột ái lực miễn dịch (IAC)

Sắc ký ái lực miễn dịch là một phương pháp toàn năng trong phân lập chọn lọc chất phân tích từ nền mẫu phức tạp. Do đó, cột ái lực miễn dịch (IAC) được dùng trong giai đoạn chuẩn bị hay phân tích chọn lọc. Cột IAC có thể dùng để xác định gián tiếp hay trực tiếp khi kết hợp với các phương pháp như HPLC, GC, MS và CE. 

• Rửa giải bật/ tắt & phương pháp xác định trực tiếp

Chế độ bật/ tắt của IAC thường dùng trong lĩnh vực sinh hóa hoặc tinh chế chọn lọc các chất phân tích từ nền mẫu phức tạp. Các hợp chất có thể phân lập bằng cột ái lực miễn dịch bao gồm protein, glycoprotein, carbohydrate, lipid, vi khuẩn, thuốc và tác nhân môi trường. Ngoài ra, cột ái lực miễn dịch (IAC) còn dùng để xác định chất phân tích khi kết hợp với đầu dò phù hợp. Với trường hợp này, chất phân tích phải có nồng độ tương đối cao. Khi rửa giải cho hình dạng peak sắc nét, định tính được và giới hạn phát hiện tốt. Tùy thuộc vào giới hạn phát hiện, đầu dò UV – VIS, huỳnh quang hoặc MS đều có thể dùng để xác định chất phân tích trong IAC.

• Miễn dịch và suy giảm miễn dịch

Khi cột ái lực miễn dịch (IAC) được dùng để loại bỏ một hoặc nhóm chất phân tích cụ thể ra khỏi mẫu trước khi phân tích bằng phương pháp khác, được gọi là phương pháp phân tích miễn dịch. Giống với kỹ thuật SPE truyền thống, phần rửa giải từ cột IAC có thể được 

thu hồi, làm khô và hòa tan trong dung môi thích hợp hơn để phân tích. Đôi khi, mẫu cũng có thể được tạo dẫn xuất trước khi phân tích. Phương pháp tách miễn dịch kết hợp với phương pháp khác dùng trong phân tích mẫu nước tiểu, thực phẩm, nước và đất. Ví dụ một số chất phân tích được kiểm tra bằng phương pháp này như e α1-anti-trypsin, atrazine, benzylpenicilloyl-peptides, albumin trong huyết thanh bò, carbendazim, chloramphenicol, cortisol, clenbuterol và phenytoin.

Một phương pháp khác ứng dụng trên cột ái lực miễn dịch (IAC) là suy giảm miễn dịch. Trong phương pháp này, cột ái lực miễn dịch (IAC) được dùng để loại bỏ các chất phân tích có lượng đáng kể trong mẫu. Sau đó, các thành phần còn lại được phân tích bằng phương pháp khác. Thông thường, phương pháp này dùng để loại bỏ các protein lượng lớn và trung bình ra khỏi mẫu có ít thành phần. Một số phương pháp khác cũng dùng để loại bỏ lượng mẫu trung bình và lớn, ví dụ như kết tủa, SPE, ly tâm, phân tách dựa trên trọng lượng phân tử… Điểm khác biệt là phương pháp suy giảm miễn dịch có khả tăng tách chọn lọc đồng thời nhiều protein.

• Phương pháp IAC kết hợp

Bằng cách kết hợp phương pháp phân tích miễn dịch với phương pháp phân tích khác, ví dụ như HPLC, tiền xử lý mẫu có thể được tự động hóa. Phân tích bằng cột ái lực miễn dịch (IAC) thường được kết hợp với sắc ký pha đảo (RPLC). Ngoài ra, cột IAC còn có thể kết hợp với phương pháp sắc ký trao đổi ion, CE, MS và GC. Sự kết hợp giữa IAC và RPLC dùng trong phân tích mẫu thực phẩm, dịch sinh học, dịch tế bào và mẫu môi trường.

Ví dụ ở hình 3, cột ái lực miễn dịch (IAC) dùng để chiết hoặc làm giàu mẫu phân tích trước khi chúng được phân tách bằng cột sắc ký pha đảo. Kết quả thu được dùng để định lượng virginiamycin trong nước với LOD = 1 ppb.

Sự kết hợp giữa cột ái lực miễn dịch và sắc ký pha đảo

• Xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh

1. Xét nghiệm đồng thời

Trong loại xét nghiệm miễn dịch này, mẫu hỗn hợp gồm chất phân tích và chất chuẩn được tiêm vào cột ái lực miễn dịch (IAC). Mẫu phân tích và chất chuẩn được giữ lại trong cột, các chất khác không lưu giữ. Sau đó, hỗn hợp này được rửa giải bằng pha động/ dung dịch đệm thích hợp. Nồng độ chất phân tích sẽ tỉ lệ nghịch với nồng độ chất chuẩn.

Xét nghiệm đồng thời bằng cột ái lực miễn dịch (IAC)

2. Xét nghiệm tuần tự

Với xét nghiệm tuần tự, mẫu được tiêm vào cột ái lực miễn dịch (IAC) và lưu giữ tại đây. Sau đó, chất chuẩn được tiêm vào cột IAC và hấp phụ lên các tâm hoạt tính còn trống. Cuối cùng, mẫu phân tích và chất chuẩn hấp phụ trên cột miễn dịch ái lực (IAC) cùng được rửa giải bằng dung dịch đệm. Lượng chất chuẩn lưu giữ được rủa giải sẽ tỉ lệ nghịch với nồng độ chất phân tích trong mẫu ban đầu.

Xét nghiệm tuần tự trong cột ái lực miễn dịch (IAC)

3. Xét nghiệm thay thế

Với loại xét nghiệm thay thế, chất chuẩn được tiêm vào cột ái lực miễn dịch (IAC) trước. Sau đó, mẫu phân tích được tiêm vào cột IAC và thay thế vị trí của một số chất chuẩn. Mẫu phân tích được định lượng thông qua diện tích peak của chất chuẩn.

 Xét nghiệm thay thế trong cột ái lực miễn dịch (IAC)

• Xét nghiệm miễn dịch không cạnh tranh

1. Xét nghiệm “Sandwich”

Trong kiểu xét nghiệm này, mẫu phân tích được tiêm vào cột ái lực miễn dịch (IAC) và liên kết với kháng thể trong cột. Sau đó, chất chuẩn đã đính với kháng thể bên ngoài được tiêm vào cột IAC. Phức hợp này vẫn đính được với chất chuẩn nhờ vào tâm hoạt tính trống tạo thành hình dạng giống “sandwich”. Rửa giải bằng dung dịch đệm nhằm phá vỡ liên kết kháng thể kháng nguyên và tái tạo cột. Lượng phức hợp được rửa giải trong bước này tỉ lệ thuận với lượng chất phân tích ban đầu.

Xét nghiệm “Sandwich” trong cột ái lực miễn dịch (IAC)

2. Xét nghiệm “one-site”

Trong kiểu xét nghiệm này, chất phân tích và phức hợp chất chuẩn – kháng thể được trộn và ủ trước khi tiêm vào cột ái lực miễn dịch (IAC). Cột IAC chứa chất phân tích tạo liên kết với kháng thể còn tâm hoạt tính, phức hợp chất chuẩn – kháng thể được rửa giải không lưu giữ được rửa giải ra ngoài. Lượng phức hợp được rửa giải cung cấp thông tin trực tiếp để định lượng chất phân tích ban đầu. Cột ái lực miễn dịch sau đó được tái tạo bằng cách rửa giải hết chất chuẩn – kháng thể hấp phụ.

Xét nghiệm “one-site” trong cột ái lực miễn dịch (IAC)

• Xác định bằng cột ái lực miễn dịch sau phương pháp phân tích khác

Cột ái lực miễn dịch (IAC) cũng dùng để xác định chất phân tích hiện diện trong mẫu sau khi chúng được rửa giải từ cột sắc ký khác. Chất phân tích có thể được xác định trực tiếp hay gián tiếp. Thông thường, một lò cột chứa cột ái lực miễn dịch (IAC) được ghép nối vào đầu thải của cột HPLC. Khi chất phân tích được rửa giải, chúng được trộn với lượng dư kháng thể đã đánh dấu. Lượng kháng thể còn lại sau đó được loại bỏ bằng thành phần tương tự tạo nên cột IAC. Sau đó, phức hợp chất phân tích – kháng thể được phân tách trong cột ái lực miễn dịch (IAC). Tín hiệu thu nhận được sẽ tỉ lệ với nồng độ chất phân tích. Khi thực hiện phương pháp này, cần đảm bảo chất phân tích rửa giải từ cột HPLC được điều chỉnh để cho hiệu suất liên kết với kháng thể là tối đa (pH, độ mạnh ion và loại bỏ/ hạn chế các tác nhân hữu cơ).

Xác định bằng cột ái lực miễn dịch (IAC) sau phương pháp phân tích khác

Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2903764/#R15